Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) sistemlerinde başarıya giden yol, sadece doğru kolon veya güçlü bir dedektör seçimiyle sınırlı değildir. Sistemin verimliliğini doğrudan etkileyen en önemli bileşenlerden biri mobil fazdır.
Mobil fazın bileşimi, hazırlanışı, kalitesi ve sistem içindeki davranışı; elde edilecek verinin güvenilirliğini doğrudan etkiler.
Mobil Faz Nedir?
Mobil faz (elüent), HPLC sisteminde sabit fazla etkileşime girecek olan analitleri taşıyan sıvı ortamdır. Bu çözücü karışımı, kolon içinden yüksek basınçla geçirilerek örnek bileşenlerinin ayrılmasını sağlar.
Mobil fazın görevleri:
-
Örnek bileşenlerini kolona taşımak
-
Ayrımı gerçekleştirecek kimyasal ortamı sağlamak
-
Dedektöre net ve kararlı sinyal iletmek
Mobil Fazın Kalitesi Neden Önemlidir?
-
Düşük kaliteli çözücüler, dedektör sinyalinde gürültü ve sürüklenmeye (drift) neden olabilir.
-
Mikroskobik partiküller, kolonu tıkayabilir veya sistemde basınç dalgalanmalarına yol açabilir.
-
Gaz kabarcıkları, dedektörde sinyal bozuklukları oluşturur.
-
pH ve iyon gücü farkları, tutunma sürelerini değiştirerek kromatogramın güvenilirliğini bozar.
Mobil Faz Hazırlama Aşamaları
-
Uygun çözücü seçimi (örneğin: metanol, asetonitril, su)
-
Doğru oranlarda karışım (örneğin: %70 ACN / %30 Su)
-
Filtrasyon (0.45 µm ya da 0.22 µm membran filtreden geçirilmeli)
-
Degaze Etme (gaz giderimi)
-
Etiketleme ve uygun koşullarda saklama (ışık, sıcaklık, süre)
Degaze Etme (Gaz Giderimi) Neden Gereklidir?
Mobil faz içinde çözünmüş hava kabarcıkları, özellikle UV dedektörlerde yalancı sinyaller (gürültü) oluşturabilir. Ayrıca pompa sisteminde basınçlı akışa, kolon içi basınç değişimlerine ve sistem kararsızlıklarına yol açabilir.
Degaze Etme yöntemleri:
-
Ultrasonik banyo ile degaze etme
-
Vakum altında degaze etme
-
Helium purging (He gazı ile kabarcıkların uzaklaştırılması)
-
Inline degasser (Entegre degazlama ünitesi – modern sistemlerde)
İpuçları ve Dikkat Edilmesi Gerekenler
-
Mobil faz hazırlanırken taze çözücüler kullanın
-
Karışım oranlarını mutlaka terazide veya hacimsel ölçü ile yapın
-
pH ayarlamalarında kalibre edilmiş pH metre kullanın
-
Mobil faz kabını ışık geçirmeyen ve hava geçirmez kaplarda saklayın
-
İzokratik sistemlerde uzun süreli kullanımlarda çözücünün buharlaşmasını önlemek için kapak kapalı tutulmalı
-
Gradyan sistemlerde çözücü uyumu ve viskozite farklarına dikkat edilmeli
Mobil faz, HPLC analizinin omurgasını oluşturur. Kaliteli, doğru hazırlanmış ve uygun şekilde kullanılmış bir mobil faz, sistemin performansını artırır, kromatogram kalitesini yükseltir ve sonuçların güvenilirliğini garanti altına alır.
Göz ardı edilen mobil faz detayları, en iyi kolon ve dedektörle bile başarısız analizlere yol açabilir.
