Analitik metot (yöntem) geliştirme, tüm analizler için kritik bir süreç olarak kabul edilir. Farklı kolon tiplerinin, çalışma parametrelerinin, mobil faz bileşiminin, çözücünün ve pH değerlerinin mevcut olması, analitik bir yöntem geliştirmeyi kritik hale getirir.
İyi bir analitik yöntem basit olmalı; kullanılan kolon, mobil faz ve tampon yaygın olmalıdır. HPLC sisteminde metot geliştirme süreci adım adım kolayca yapılabilir.
- HPLC Analitik Metodun Seçimi
- Kromatografik Koşulların Seçimi
- Parametre Optimizasyonu
1. HPLC Analitik Yönteminin Seçimi
Öncelikle ürünle ilgili mevcut literatürü inceleyin. Bu, farklı parametreleri seçmenize yardımcı olacak ürünün doğasını anlamanıza yardımcı olur.
A. Örnek Hazırlama: Örneği, çözünürlüğüne, filtrasyon gereksinimlerine, ekstraksiyon gereksinimlerine veya diğer özel gereksinimlere göre hazırlama yöntemini seçin ve HPLC analizine uygun net bir çözüm elde edin.
B. Kromatografi: Çoğu örnek için ters faz kromatografi kullanılır, ancak örnekte asidik veya bazik moleküller bulunduğunda ters faz iyon baskılama (zayıf asit veya baz için) veya ters faz iyon eşleştirme (güçlü asit veya baz için) kullanılmalıdır. Sabit faz C18 bağlı olmalıdır. Düşük veya orta polarite analiti için normal faz kullanılır, özellikle ürün izomerlerinin ayrılması gerektiğinde. Normal faz ayrımları için siyano bağlı fazı seçin. İyon değişim kromatografisi, inorganik anyon veya katyon analizinde en iyisidir. Analit yüksek moleküler ağırlığa sahipse, boyut dışlama kromatografisi en iyi seçenek olacaktır.
C. Gradient/İzotonik HPLC: Gradient HPLC, çok sayıda bileşene sahip karmaşık örneklerin analizinde yardımcı olur. İzotonik HPLC’ye göre daha yüksek çözünürlük elde etmeye yardımcı olur ve sabit pik genişliği sağlarken, izotonik HPLC’de pik genişliği alıkonma süresiyle (retention time) artar. Gradient HPLC, özellikle daha uzun tutma süresine sahip ürünler için büyük duyarlılığa sahiptir.
D. Kolon Boyutu: Çoğu örnek için 100-150 mm kolonlar kullanılır. Bu, yöntem geliştirme ve analiz süresini azaltır. Daha büyük kolonlar, ayrılma süresi daha uzun olan karmaşık örnekler için kullanılır. Başlangıçta, akış hızı 1 ila 1.5 ml/dak arasında olmalı ve kolon partikül boyutu 3 ila 5 µm arasında olmalıdır.
E. HPLC Dedektörleri: Analitin UV ile tespit edilebilen kromoforları varsa, UV dedektörü kullanmak daha iyidir. Farmasötik çalışmalarda UV dedektörü her zaman diğerlerine göre daha iyidir. İz analizi için floresans ve elektro-kimyasal dedektörler kullanılmalıdır. Yüksek konsantrasyonlu örnekler, kırılma indisi dedektörleri kullanılarak analiz edilmelidir.
F. Dalga Boyu: Örnek λmax, UV ışığa karşı en yüksek duyarlılığa sahiptir. Kromoforları olan örnek bileşenlerini tespit eder. 200 nm’nin üzerindeki dalga boyu, daha düşük dalga boylarından daha yüksek duyarlılık sağlar. 200 nm’nin altındaki dalga boyları daha fazla gürültü oluşturur, bu nedenle kaçınılmalıdır.
2. Kromatografik Koşulların Seçimi
Analitik yöntemin seçilmesinin ardından, farklı kromatografik koşullar seçilir. Analitlerin kolondan akışı, mobil fazdaki çözücü konsantrasyonuna bağlıdır. Çözücü konsantrasyonu genellikle alıkonma süresini kontrol etmek için kullanılır. Mobil faz pH’ı ve iyon eşleştirme reaktifleri de örneğin alıkonma süresini etkiler. Çok sayıda bileşen içeren örnekler, büyük alıkonma süresinden kaçınmak için gradient kullanılarak analiz edilirken, bir veya iki bileşen içeren örnekler izotonik sistemde analiz edilir.
3. Parametre Optimizasyonu
Tekrarlı örnek çalışmaları yapıldıktan sonra, kolon boyutları, partikül boyutu, çalışma süresi ve akış hızı gibi bazı parametreler en iyi çözünürlüğü ve minimum çalışma süresini elde etmek için optimize edilir.
Analiz yönteminin uygun şekilde optimize edilmesinin ardından, analitik yöntemin tutarlılığını sağlamak için doğrulama (validasyon) yapılır. Analitik yöntem doğrulaması, tüm düzenleyici otoriteler tarafından zorunlu hale getirilmiştir.
